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摘要
顯微CT在生物軟組織成像中常面臨對比度不足的問題，臨界點(diǎn)干燥是提升圖像質(zhì)量的關(guān)鍵前處理步驟。本文系統(tǒng)介紹該技術(shù)的操作流程，并結(jié)合昆蟲肌肉、腦部及幼蟲器官三大案例，為相關(guān)領(lǐng)域研究者提供可復(fù)用的實(shí)驗(yàn)方案。
顯微CT成像的挑戰(zhàn)與突破
傳統(tǒng)的顯微CT成像對骨骼、牙齒等高密度結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出色，但對于軟組織結(jié)構(gòu)，由于低原子序數(shù)元素的弱吸收特性，成像對比度常不理想。臨界點(diǎn)干燥技術(shù)通過溫和去除樣本中的液體，最大程度減少組織收縮與變形，顯著提升信噪比，是獲取高質(zhì)量三維重建數(shù)據(jù)的必備步驟。
三大案例展示臨界點(diǎn)干燥的實(shí)際應(yīng)用
案例一：書蝎肌肉系統(tǒng)顯微CT成像方法
樣本類型
物種：書蝎（Neobisium sp.）
目標(biāo)：肌肉系統(tǒng)三維結(jié)構(gòu)可視化
Courtesy of Elisabeth Lipke and Dr. Peter Michalik, University of Greifswald, Germany.
推薦標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程
（基于Leica EM CPD300）
1
樣本裝載
使用微孔樣本罐，置于“濾片與多孔罐支架”中。
2
固定與脫水
70% 乙醇中固定，過夜
乙醇梯度脫水：
? 80% 乙醇，10分鐘
? 90% 乙醇，10分鐘
? 96% 乙醇，10分鐘
? 100% 乙醇，2次，每次10分鐘
3
染色
使用1% 碘乙醇溶液（溶于100%乙醇）過夜染色
100% 乙醇沖洗2次，每次10分鐘
4
臨界點(diǎn)干燥
使用Leica EM CPD300全自動程序處理
5
掃描
干燥樣本粘附于樣品臺上
使用X射線顯微CT系統(tǒng)掃描
案例二：蒼蠅腦部神經(jīng)結(jié)構(gòu)顯微CT成像方法
樣本類型
物種：綠頭蒼蠅（Lucilia caesar）
目標(biāo)：腦部神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)三維重建
Courtesy of Elisabeth Lipke and Dr. Peter Michalik, University of Greifswald, Germany.
推薦標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程
（基于Leica EM CPD300）
1
樣本裝載
樣本單獨(dú)放置于“節(jié)肢動物支架”的腔室中。
2
固定與脫水
Bouin固定液過夜固定
0.1 M磷酸緩沖液（含1.8%蔗糖，pH 7.2）沖洗3次，每次10分鐘
乙醇梯度脫水：
? 60%、70%、80%、90%、96%、100%乙醇，每步10分鐘
? 100%乙醇重復(fù)2次
3
染色
1% 碘乙醇溶液過夜染色
100% 乙醇沖洗2次，每次10分鐘
4
臨界點(diǎn)干燥
使用Leica EM CPD300全自動程序處理
5
掃描
干燥樣本粘附于樣品臺上
使用X射線顯微CT系統(tǒng)進(jìn)行高分辨率掃描
案例三：紅血蟲幼蟲器官系統(tǒng)顯微CT成像方法
樣本類型
物種：搖蚊幼蟲（紅血蟲）
目標(biāo)：幼蟲內(nèi)部器官系統(tǒng)三維重建
Courtesy of Elisabeth Lipke and Dr. Peter Michalik, University of Greifswald, Germany.
推薦標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程
（基于Leica EM CPD300）
1
樣本裝載
樣本單獨(dú)放置于“節(jié)肢動物支架”腔室中。
2
固定與脫水
2.5% 戊二醛（溶于0.1 M磷酸緩沖液）過夜固定
0.1 M磷酸緩沖液（含1.8%蔗糖，pH 7.2）沖洗3次，每次10分鐘
乙醇梯度脫水：
? 60%、70%、80%、90%、96%、100%乙醇，每步10分鐘
? 100%乙醇重復(fù)2次
3
染色
1% 碘乙醇溶液過夜染色
100% 乙醇沖洗2次，每次10分鐘
4
臨界點(diǎn)干燥
使用Leica EM CPD300全自動程序處理
5
掃描
干燥樣本粘附于樣品臺上
使用X射線顯微CT系統(tǒng)掃描
技術(shù)總結(jié)
以上三種方法均采用：
標(biāo)準(zhǔn)化乙醇梯度脫水
碘乙醇染色增強(qiáng)對比
Leica EM CPD300全自動干燥
顯微CT系統(tǒng)掃描
流程可根據(jù)樣本硬度、大小與結(jié)構(gòu)復(fù)雜度進(jìn)行微調(diào)，適用于絕大多數(shù)昆蟲及軟體生物樣本的顯微CT前處理。
儀器推薦：Leica EM CPD300
全自動操作，溫控精準(zhǔn)，樣本放進(jìn)去就不用管了，簡直是實(shí)驗(yàn)室的“干燥神器”！
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EM CPD300臨界點(diǎn)干燥儀
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